Biokémiai gyakorlatok

Tartalom

1. BIOKÉMIAI ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI GYAKORLATOK
1.1. Aminosavak szétválasztása és meghatározása ioncserés vékonyrétegkromatográfiával 7
1.2. Cukrok elválasztása és kvalitatív analízise vékonyrétegkromatográfiás
eljárással 9
1.3. Lipidek vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata 11
1.4. Fehérjeoldat sómentesítése gélszűréssel 12
1.5. Fehérjék móltömegének meghatározása gélkromatográfiával 13
1.6. Szérumfehérjék elválasztása ioncserével DEAE-cellulóz oszlopon 15
1.7. Savas foszfatáz izoenzimek szétválasztása DEAE-cellulóz oszlopon 17
1.8. A GAPD affinitáskromatográfiás tisztítása 19
1.9. Fehérjék molekulatömegének meghatározása SDS gélelektroforézissel 21
1.10. Fehérjék izoelektromos pontjának meghatározása 24
2. AMINOSAVAK, FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK
2.1. Aminosavak és fehérjék vizsgálata 27
2.1.1. Fenilalanin és triptofán oldat spektrumának felvétele és koncentrációjának
meghatározása 27
2.1.2. Aminosavak pK értékeinek meghatározása titrálással 28
2.1.3. N-terminális aminosavak meghatározása danzil reagenssel 29
2.1.4. Aminosavak kvantitatív meghatározása ninhidrin reakcióval 31
2.1.5. Fehérjék kvantitatív meghatározása Biuret reakcióval, Bradford és
Folin reagenssel, valamint UV abszorpciójuk alapján 32
2.1.6. Fehérje konformáció változásának vizsgálata tripszines emészthetőség
mérésével 35
2.1.7. Citokróm c preparálása 36
2.1.8. Citokróm c oxidált és redukált formáinak spektrofotometriás mérése a látható
színképtartományban 37
2.1.9. a-krisztallin preparálás marha szemlencséből 38
2.2. Enzimológiai mérések 40
2.2.1. Tirozináz aktivitás megoszlása gombában 40
2.2.2. Kísérletek fehérjebontó enzimekkel 41
2.2.3. Tripszin aktivitásának meghatározása Anson teszttel 43
2.2.4. Tripszin esszenciális szerin OH-csoportjának módosítása PMSF-dal. A tripszin
koncentráció meghatározása specifikus gátlás segítségével 44
2.2.5. Savas foszfatáz izolálása búzacsírából 45
2.2.6. Savas foszfatáz kinetikai vizsgálata 47
2.2.7. Savas foszfatáz szubsztrátspecifitásának, gátlásának és stabilitásának vizsgálata. 49
2.2.8. Kísérletek alkalikus foszfatázzal 51
2.2.9. A torma peroxidáz vizsgálata 52
2.2.10. Apiráz enzim preparálása 54
2.2.11. Apiráz enzim aktivitásának mérése 55
2.2.12. Gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz izolálása sertés-vázizomból,
a GAPD átkristályosítása és aktivitásának mérése 56
2.2.13. A GAPD szulfhidril csoportjainak szerepe a NAD+ koenzim megkötésében 58
2.2.14. A GAPD szulfhidril csoportjainak analízise Ellmann reakcióval 59
2.2.15. D-aminosav oxidáz holoenzim aktivitásának mérése 60
2.2.16. D-aminosav oxidáz (DAO) szerkezetének és működésének vizsgálata 62
2.2.17. Lizozim tisztítása tojásfehérjéből, tisztaságának ellenőrzése gélelektroforézissel 63
2.2.18. a-kimotripszin inaktiválódásának vizsgálata etanol jelenlétében 65
2.2.19. a-kimotripszin stabilizálása etanolos közegben polietilén glikollal 66
2.2.20. a-krisztallin stabilizáló hatásának vizsgálata 67
2.3. Kísérletek rögzített enzimekkel 68
2.3.1. Tej sav dehidrogenáz rögzítése 69
2.3.2. A rögzített tejsav dehidrogenáz tulajdonságainak vizsgálata 71
2.3.3. LDH enzim oszlopreaktorral végzett analitikai meghatározások 73
2.3.4. Glükóz oxidáz rögzítése 75
3. NUKLEINSAVAKKAL KAPCSOLATOS GYAKORLATOK
3.1. Máj szövet DNS és RNS tartalmának meghatározása 82
3.1.1. DNS meghatározása difenilaminnal 82
3.1.2. RNS meghatározása orcinol reagenssel 82
3.2. DNS és RNS megoszlásának meghatározása a differenciál centrifugálással
nyerhető sejtmag és felülúszó frakciókban 83
3.3. DNS preparálás baktérium tenyészetből és a preparált DNS tisztaságának
ellenőrzése agaróz gélen 84
3.3.1. DNS preparálás Escherichia coli baktérium tenyészetből 84
3.3.2. E. coli DNS preparátum tisztaságának ellenőrzése agaróz gélen 85
3.4. DNS hiperkróm effektusának vizsgálata 86
3.5. Nukleinsavak hidrolízise és vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata 87
4. SZÉNHIDRÁTOK VIZSGÁLATA
4.1. Összcukortartalom meghatározása biológiai objektumokban 89
4.1.1. A biológiai minta fehérje mentesítése 89
4.1.2. Összcukortartalom meghatározás Anthron módszerrel 89
4.2. Glükóz mennyiségi meghatározása glükóz oxidázzal 90
4.3. Glikogén izolálása májból és szerkezetének vizsgálata 91
4.3.1. Glikogén izolálása májból 91
4.3.2. A glikogén tisztaságának meghatározása 92
4.3.3. A glikogén molekula szerkezetének vizsgálata 93
5. LIPIDEK VIZSGÁLATA
5.1. Foszfolipidek kvantitatív meghatározása 97
5.2. Neutrális zsírok enzimatikus hidrolízise 98
5.3. Foszfatidil-kolin és koleszterin preparálása tojás sárgájából 100
5.4. Foszfatidil-kolin és koleszterin tisztaságának ellenőrzése vékonyrétegkromatográfiával
6. ÖSSZETETT BIOKÉMIAI RENDSZEREK VIZSGÁLATA
6.1. Az aktív transzport vizsgálata élesztő sejtekben 103
6.2. Permeabilitás vizsgálatok liposzómákon 107
6.3. Enzimek szubcelluláris lokalizációja 109
6.4. Élesztősejtek rögzítése 111
6.4.1. A pH hatásának vizsgálata a rögzített sejtek etanol fermentáló képességére 114
6.4.2. Rögzített élesztősejtek etanol termelése 116
6.4.3. Etanol termelés szabad és rögzített élesztősejtekkel 117
6.5. Glikolízis tanulmányozása patkány vörösvértestekkel 119
6.6. Halak citokróm P450 függő monoxigenázainak vizsgálata 121
7. KÖRNYEZET-BIOKÉMIAI VIZSGÁLATOK
7.1. Szövetkárosodás detektálására alkalmas enzimek (GOT, GPT) vizsgálata
ponty szövethomogenizátumaiban 127
7.2. Stresszhatás kimutatása vércukor és LDH szint mérésével pontyban 129
7.3. Peszticidek okozta idegrendszeri károsodás detektálása 131
7.4. A kolinészteráz in vitro gátlása methidationnal (számolási gyakorlat) 132
7.5. Az acetil-kolinészteráz molekuláris formáinak megoszlása tavi ponty szerveiben 134
7.6. Az LDH izoenzimek kinetikai mérése ponty szív- és laterális fehér izmából 137
7.7. Hőmérsékleti akklitamizáció hatása az aerob és anaerob anyagcserére 139
7.8. Az oxidatív stressz mérése 140

Témakörök