Enzimes analízis

Tartalom

1. Enzimek és metabolitok mennyiségi meghatározásának elvi alapjai 11
1.1. A meghatározási módszerek 13
1.1.1. Fotometriás módszerek (Batke József) 13
1.1.1.1. Az. abszorpciós fotometria mennyiségi összefüggései 14
1.1.1.2. A fluoreszcenciaemissziós fotometria mennyiségi összefüggései 16
1.1.1.3. Abszorpciós és fluoreszcenciás módszerek alkalmazása az enzimológiában 17
1.1.2. Radioaktív izotópos módszerek (Gaál József) 21
1.1.2.1. Enzimek mennyiségi meghatározása izotóptechnikával 24
1.1.2.2. Enzimaktivitás meghatározása 25
1.1.2.3. Metabolitok mennyiségi meghatározása radioenzimatikus módszerrel 28
1.2. Az enzimreakciók jellemzése (Szabolcsi Gertrúd) 30
1.2.1. A szubsztrát, a termék, a koenzim és a prosztetikus csoport fogalma 30
1.2.2. Az enzimreakciók csoportosítása a sztöchiometria alapján 31
1.2.3. Katalizált reakciók és a termodinamikai egyensúly 32
1.2.4. Az egyensúly problémájának megkerülése az enzimaktivitás mérése során. Az enzimreakció kezdeti sebességének fogalma 34
1.2.5. A pH hatása az egyensúly helyzetére és az ebből származó előnyök 36
1.3. Az enzimek mennyiségi meghatározása a katalizált reakció sebessége, ill. sebességi állandója alapján (Szabolcsi Gertrúd) 38
1.3.1. Egyszubsztrátos enzimreakciók sebességének egyenlete (Michaelis-Menten-féle egyenlet) 38
1.3.1.1. A sebesség (enzimaktivitás) meghatározása 41
Szubsztrátra nézve nulladrendű reakciók 41
Szubsztrátra nézve elsőrendű reakciók 44
1.3.1.2. Gyakorlati meggondolások 47
1.3.2. A sebesség meghatározásának elve két- vagy többszubsztrátos enzimreakciók esetében 48
1.3.3. Konszekutív (kapcsolt) enzimreakciók mérésének elve 51
1.3.4. A hőmérséklet, a pH és az ionerősség hatása az enzimreakció sebességére 56
1.3.5. Limitált proteolitikus folyamatok 57
1.4. Az enzimek mennyiségi meghatározását zavaró tényezők (Kazinczyné, Vas Mária) 61
1.4.1. Zavaró (szennyező) enzimek jelenléte 61
1.4.1.1. Több enzim katalizálja a szubsztrát különböző utakon történő átalakulását 62
1.4.1.2. Zavaró (szennyező) enzimek a vizsgált enzimreakció mérni kívánt termékét használják szubsztrátként 65
1.4.2 Az enzimek instabilitásával járó gondok 69
1.41 Bomlékony szubsztrát, illetve bomlékony termék hatása az enzimreakció sebességére 69
1.4.3.1. Bomlékony szubsztrát 69
1.4.3.2. Bomlékony termék 72
1.4.4 Reverzibilis és irreverzíbilis inhibitorok (aktivátorok) hatasa az enzimreakcio sebességére. Gátlástípusok elkülönítése 73
1.4.4.1 Reverzibilisen kötődő inhibitorok 74
Reverzibilis inhibitorok minőségi jellemzése kinetikai analízissel 75
Az enzimmennyiség meghatározása inhibitort tartalmazó biológiai mintában 79
1.4.4.2. Irreverzíbilis inhibitorok 80
1.4.5. Szubsztrátfelesleg-és termékgátlás (-aktiválás). Alloszterikus effektorok 81
1.4.5.1. Szubsztrátfelesleg gátló hatása 82
1.4.5.2. A termék gátló hatása 83
1.4.5.3. Alloszterikus etfektorok 84
1.5. Az enzimek stabilitásának kérdése: az inaktiválás és reaktiválás jelensége (Szabolcsi Gertrúd) 86
1.5.1. Az inaktiválás típusai 89
1.5.1.1. Hőinaktiválás 89
1.5.1.2. pH inaktiválás 90
1.5.1.3. Oxidatív és reduktív inaktiválás 90
1.5.1.4. Karbamid (urea) és guanidin-hidroklorid inaktiváló hatása 91
1.5.1.5. Proteolitikus inaktiválás 91
1.5.1.6. Szerves oldószerek, detergensek és nehézfémsók hatása az enzimekre 92
1.5.2. Reverzibilis inaktiválás, ill. denaturáció 93
1.5.3. Gyakorlati meggondolások 95
Irodalom 97
2. Enzimek mennyiségi meghatározása 99
2.1. Általános útmutatás (Szabolcsi Gertrúd) 101
2.1.1. Az enzimmennyiség számítása kat-, ill. U-ban (kinetikus módszer) 101
2.1.2. Az enzimmennyiség meghatározása a reakció sebességi állandója, ill. a szubsztrátátalakulás felezési ideje alapján 106
2.1.3. Az enzimmennyiség számítása önkényes egységekben 110
2.1.4. Zavaró (szennyező) enzimek kimutatása és mennyiségi meghatározása 11 1
2.1.5. Takarékossági szempontok a reakcióelegyek összeállítása során 112
Irodalom 114
2.2. Egyes enzimek mennyiségi meghatározása 115
2.2.1. Oxidoreduktázok (EC 1.) 115
2.2.1.1. Dehidrogenázok 115
Alkohol dehidrogenáz (Cseke Emília) 115
L-a-glicerin-3-foszfát dehidrogenáz (Gálné, Telegdi Marianna) 121
Laktát dehidrogenáz (Gálné, Telegdi Marianna) 128
Malát dehidrogenáz (Gálné, Telegdi Marianna) 135
Izocitrát dehidrogenáz (Gálné, Telegdi Marianna) 142
GIukonát-6-foszfát dehidrogenáz (Cseke Emília) 149
Glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (Cseke Emília) 153
Glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Kaúnczyné, Vas Mária) 158
2.2.1.2. Egyéb oxidoreduktázok 165
Glükóz oxidáz (Polacsekné, Rácz Mária) 165
D- és L-aminosav oxidáz (Szajáni Béla) 169
Monoamin oxidáz (Gaál József) 175
Kataláz (Cseke Emília) 1 sí
Peroxidáz (Cseke Emília és Vámosné, Vigyázó Lilly) 187
Lipoxigenáz ( Vámosné, Vigyázó Lilly) 195
Dopamin B-hidroxiláz (Gaál József) 199
Polifenol oxidáz (Vámosné, Vigyázó Lilly) 203
2.2.2. Transzferázok (EC 2.) 209
Katecholamin-O-metil transzferáz (Gaál József) 209
Kolin acetil transzferáz (Gaál József) 213
Glikogén foszforiláz (Dombrádi Viktor) 217
Glutamát-oxál-acetát transzamináz (Gálné, Telegdi Marianna és Körmendy László) 222
Glutamát- piruvát transzamináz (Gálné, Telegdi Marianna) 234
Hexokináz (Cseke Emília) 240
Piruvát kináz (Cseke Emília és Gálné, Telegdi Marianna) 244
Glicerát-3-foszfát kináz (Kazinczyné, Vas Mária) 251
Adenilát kináz (miokináz) (Cseke Emília) 257
2.2.3. Hidrolázok (EC 3.) 260
2.2.3.1. Észterázok 260
Acetil- és butiril-kolin észteráz (Cseke Emília) 260
Savanyú foszfo-monoészteráz (foszfatáz) (Körmendy László) 264
3',5'-ciklikus nukleotid foszfo-diészteráz (Friedrich Péter és Solti Magda) 268
2.2.3.2. Poli- és diszacharidok bontását katalizáló enzimek 274
a-amiláz (Hoschke Ágoston) 274
B-amiláz (Hoschke Ágoston) 280
Glükoamiláz (Hoschke Ágoston) 285
Lizozim (Polgár László) 290
Maltáz (Hoschke Ágoston) 292
B-galaktozidáz (Polacsekné, Rácz Mária) 296
Celluláz (Szakácsné, Dobozi Mária) 299
Pektinbontást katalizáló enzimek ( Vámosné, Vigyázó Lilly) 313
2.2.3.3. Nukleinsavak bontását katalizáló enzimek 324
Restrikciós endonukleázok ( Venetiáner Pál) 324
2.2.3.4. Proteolitikus enzimek
Karboxipeptidáz-A (Polgár László)
Tripszin és tripszin-inhibitor (Szabolcsi Gertrúd) 334
Trombin (Machovich Raymund) 346
Plazmin (Machovich Raymund) 351
Szubtilizin (Polgár László) 354
Katepszin-B (Polgár László) 357
Papain (Polgár László) 361
Kimozin ( Vámosné, Vigyázó Lilly) 364
2.2.3.5. Nempeptid C- N-kötés hidrolázok 368
Ureáz (Gálné, Telegdi Marianna) 368
Aminő aciláz (Szajáni Béla) 371
2.2.4. Liázok (EC 4.) 377
Aldoláz (Szabolcsi Gertrúd) 377
Adenilát cikláz (Gaál József) 383
2.2.5. Izomerázok (EC 5.) 389
Glükóz-6-foszfát izomeráz (Polacsekné, Rácz Mária) 389
2.2.6. Ligázok (EC 6.) 392
DNS ligáz (Venetiáner Pál) 392
3. Metabolitok mennyiségi meghatározása 397
3.1. Általános útmutatás (Szabolcsi Gertrúd) 399
3.2. Egyes metabolitok mennyiségi meghatározása 402
3.2.1. Szénhidrátok 402
Glükóz (Polacsekné, Rácz Mária) 402
Fruktóz (Polacsekné, Rácz Mária) 408
Galaktóz (Polacsekné, Rácz Mária) 412
Szacharóz (Polacsekné, Rácz Mária) 414
Laktóz (Polacsekné, Rácz Mária) 418
Raffinóz (Polacsekné, Rácz Mária) 422
3.2.2. Nukleotidok 424
Adenozin-5'-monofoszfát, adenozin-5'-difoszfát és adenozin-5'-trifoszfát (Cseke Emília) 424
B-Nikotinamid-adenin-dinukleotid (Gálné, Telegdi Marianna) 428
Redukált /5-nikotinamid-adenin-dinukleotid (Gálné, Telegdi Marianna) 430
B-Nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (Gálné, Telegdi Marianna) 432
Redukált B-nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (Gálné, Telegdi Marianna) 434
3.2.3. Aminők 436
Kolin és acetil-kolin (Gaál József) 436
Katecholaminok (Gaál József) 440
Karbamid (Gálné, Telegdi Marianna) 444
Függelék 448
Rövidítések 452
Tárgymutató 457

Témakörök